一、實驗目的
以所篩選出的芽孢杆菌為實驗菌株,通過種子擴大培養,選出生長力旺盛的菌株進行液體搖瓶發酵。通過測定不同發酵時間生產的酶活,來初步估計發酵最佳時期和終點。通過本實驗要掌握測定酶活的方法。
二、實驗原理
澱粉酶是能夠分解澱粉糖苷鍵的一類酶的總稱,包括α-澱粉酶、β-澱粉酶、糖化酶和異澱粉酶。芽孢杆菌主要用來產生α-澱粉酶和異澱粉酶,其中α-澱粉酶又稱澱粉1,4-糊精酶,能夠切開澱粉鏈內部的α-1,4-糖苷鍵,將澱粉水解為麥芽糖、含有6 個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖與DNS試劑共熱呈陽性反應,產生紅棕色;而異澱粉酶又稱澱粉α-1,6-葡萄糖苷酶、分枝酶,此酶作用於支鏈澱粉分子分枝點處的α-1,6-糖苷鍵,將支鏈澱粉的整個側鏈切下變成直鏈澱粉。通過發酵實驗,AG電子遊戲平台可以以酶活為依據,初步估計發酵的最佳時期和發酵終點。
酶活力也稱酶活性,是以酶在最適溫度、最適pH等條件下,催化一定的化學反應的初速度來表示。本實驗是以一定量的澱粉酶液,於37°C、pH6.8的條件下,在一定的初始作用時間裏將澱粉轉化為還原糖,然後通過與DNS試劑作用,比色測定,求得還原糖的生成量,從而計算出酶反應的初速度,即酶的活力。這裏規定,一個澱粉酶活力單位定義為在37°C、pH6.8的條件下,每分鍾水解澱粉生成1mg還原糖所需的酶量。 三、 實驗材料及設備 1、篩選出來的產澱粉酶芽孢杆菌。
2、菌種:從商丘師院土壤中分離出的產澱粉酶的芽孢杆菌
3、種子培養基:蛋白腖1 % ,酵母浸出物0. 5 % ,氯化鈉1 % , pH自然
4、發酵培養基:按正交試驗所選的最佳方案來配置
5、儀器:控溫搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、分光光度計、燒杯、玻璃棒、錐形瓶、離心機、刻度試管: 25mL×4、容 量 瓶: 100mL×1、燒 杯: 250mL×1、滴 管 2支、洗耳球2支、洗瓶、試管架、移液管架、移液管、玻棒:各1支 四、 試劑的配製 1、培養基的配製
按上述配方稱量、溶解、滅菌
澱粉溶液(0.5%) 稱取5g可溶性澱粉,溶於1000mL熱水中。(臨用前配製) 蔗糖溶液(1%) 3、 3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑) 將5.0g 3,5-二硝基水楊酸溶於200mL 2N NaOH溶液中(不適宜用高溫促溶),接著加入500mL含130g酒石酸鉀鈉的溶液,混勻。再加入5g結晶酚和5g亞硫酸鈉,攪拌溶解後,定容至1000mL。暗處保存備用。 4、 磷酸緩衝液(0.2mol/L,pH6.8) 5、 NaOH溶液(6mol/L) 6、 NaCl溶液(0.3%) 五、 操作步驟
澱粉酶的製備 (1)菌的培養
菌種活化:將保存的菌種轉接到斜麵培養基,37 ℃培養24 h ,備用。
種子液的製備:取一環活化的菌種,接入裝量為50 mL 種子培養基的250 mL 三角瓶中,37 ℃,180 r/ min 培養18 h。
搖瓶培養:分別取1 mL 種子液,接入盛有50 mL發酵培養基的200 mL三角瓶中(接種量為2 % ,V/ V) 。置搖床中,30 ℃振蕩培養24 h ,轉速為160 r/ min
(2)酶的提取:液體培養基在3000r/min的離心機中離心10min,取上清; 2、澱粉酶活力的測定 取25mL刻度試管4支,按下表編號並操作,記錄實驗結果。
六、 結果處理 根據上表的實驗結果,以蔗糖濃度為橫坐標,光密度值為縱坐標繪製出標準曲線。
α-澱粉酶活性由下式求得:
A=(500×f/m)×〔100/(100-h)〕×(lgD1-lgD2)/(t1-t2)
=500×f·b/m)×〔100/(100-h) 〕
式中:
A──α-澱粉酶活性;
m── 100mL氯化鈣提取的試樣質量,g;
h── 試樣中水分含量,%;
f── 酶提取液的稀釋倍數;
t1、t2── 不同的反應時間,min;
D1、D2── 時間t1、t2時的吸光度;
b── lgD對t的曲線的斜率的絕對值;
500──係數。
以所篩選出的芽孢杆菌為實驗菌株,通過種子擴大培養,選出生長力旺盛的菌株進行液體搖瓶發酵。通過測定不同發酵時間生產的酶活,來初步估計發酵最佳時期和終點。通過本實驗要掌握測定酶活的方法。
二、實驗原理
澱粉酶是能夠分解澱粉糖苷鍵的一類酶的總稱,包括α-澱粉酶、β-澱粉酶、糖化酶和異澱粉酶。芽孢杆菌主要用來產生α-澱粉酶和異澱粉酶,其中α-澱粉酶又稱澱粉1,4-糊精酶,能夠切開澱粉鏈內部的α-1,4-糖苷鍵,將澱粉水解為麥芽糖、含有6 個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖與DNS試劑共熱呈陽性反應,產生紅棕色;而異澱粉酶又稱澱粉α-1,6-葡萄糖苷酶、分枝酶,此酶作用於支鏈澱粉分子分枝點處的α-1,6-糖苷鍵,將支鏈澱粉的整個側鏈切下變成直鏈澱粉。通過發酵實驗,AG電子遊戲平台可以以酶活為依據,初步估計發酵的最佳時期和發酵終點。
酶活力也稱酶活性,是以酶在最適溫度、最適pH等條件下,催化一定的化學反應的初速度來表示。本實驗是以一定量的澱粉酶液,於37°C、pH6.8的條件下,在一定的初始作用時間裏將澱粉轉化為還原糖,然後通過與DNS試劑作用,比色測定,求得還原糖的生成量,從而計算出酶反應的初速度,即酶的活力。這裏規定,一個澱粉酶活力單位定義為在37°C、pH6.8的條件下,每分鍾水解澱粉生成1mg還原糖所需的酶量。 三、 實驗材料及設備 1、篩選出來的產澱粉酶芽孢杆菌。
2、菌種:從商丘師院土壤中分離出的產澱粉酶的芽孢杆菌
3、種子培養基:蛋白腖1 % ,酵母浸出物0. 5 % ,氯化鈉1 % , pH自然
4、發酵培養基:按正交試驗所選的最佳方案來配置
5、儀器:控溫搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、分光光度計、燒杯、玻璃棒、錐形瓶、離心機、刻度試管: 25mL×4、容 量 瓶: 100mL×1、燒 杯: 250mL×1、滴 管 2支、洗耳球2支、洗瓶、試管架、移液管架、移液管、玻棒:各1支 四、 試劑的配製 1、培養基的配製
按上述配方稱量、溶解、滅菌
澱粉溶液(0.5%) 稱取5g可溶性澱粉,溶於1000mL熱水中。(臨用前配製) 蔗糖溶液(1%) 3、 3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑) 將5.0g 3,5-二硝基水楊酸溶於200mL 2N NaOH溶液中(不適宜用高溫促溶),接著加入500mL含130g酒石酸鉀鈉的溶液,混勻。再加入5g結晶酚和5g亞硫酸鈉,攪拌溶解後,定容至1000mL。暗處保存備用。 4、 磷酸緩衝液(0.2mol/L,pH6.8) 5、 NaOH溶液(6mol/L) 6、 NaCl溶液(0.3%) 五、 操作步驟
澱粉酶的製備 (1)菌的培養
菌種活化:將保存的菌種轉接到斜麵培養基,37 ℃培養24 h ,備用。
種子液的製備:取一環活化的菌種,接入裝量為50 mL 種子培養基的250 mL 三角瓶中,37 ℃,180 r/ min 培養18 h。
搖瓶培養:分別取1 mL 種子液,接入盛有50 mL發酵培養基的200 mL三角瓶中(接種量為2 % ,V/ V) 。置搖床中,30 ℃振蕩培養24 h ,轉速為160 r/ min
(2)酶的提取:液體培養基在3000r/min的離心機中離心10min,取上清; 2、澱粉酶活力的測定 取25mL刻度試管4支,按下表編號並操作,記錄實驗結果。
六、 結果處理 根據上表的實驗結果,以蔗糖濃度為橫坐標,光密度值為縱坐標繪製出標準曲線。
α-澱粉酶活性由下式求得:
A=(500×f/m)×〔100/(100-h)〕×(lgD1-lgD2)/(t1-t2)
=500×f·b/m)×〔100/(100-h) 〕
式中:
A──α-澱粉酶活性;
m── 100mL氯化鈣提取的試樣質量,g;
h── 試樣中水分含量,%;
f── 酶提取液的稀釋倍數;
t1、t2── 不同的反應時間,min;
D1、D2── 時間t1、t2時的吸光度;
b── lgD對t的曲線的斜率的絕對值;
500──係數。